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萤火虫萤光素酶
最常见的报告基因是北美萤火虫photinus pyralis的荧光素酶。该蛋白质不需要翻译后修饰即可获得酶活性。高浓度下(体内)甚至没有毒性,可用于原核和真核细胞。
图1.在带有NOVOstar酶标仪(BMG Labtech)的白色96孔板中,使用Amplite 萤光素酶报告基因基因检测试剂盒测量了萤光素酶剂量反应。该试剂盒可在20分钟至5小时的孵育时间内检测到低至0.1pg /孔的萤光素酶,而不会丢失信号强度。
Amplite 萤光素酶报告基因检测试剂盒使用无DTT配方来定量活细胞和细胞提取物中的萤光素酶活性。该检测基于萤火虫荧光素酶,萤火虫荧光素酶是一种单体的61 kD酶,可催化荧光素的两步氧化,并在560 nm处产生高度荧光。试剂盒包含所有基本成分,并具有与HTS兼容优化的“混合读取”模式。它们具有高灵敏度,可用于需要低检测限的测定。该试剂盒具有用于研究基因调控和功能的快速、简单且均一的生物发光测定法。
高斯萤光素酶
近年来,其他荧光素酶(例如高斯荧光素酶)的使用有所增加,因为这些报告基因较小,并且不需要ATP的存在。高斯荧光素酶是一种20 kD的蛋白质,可通过氧气催化腔肠素氧化,产生荧光。源自海洋co足类高斯氏菌的生物发光酶在表达后可有效地从哺乳动物细胞中分泌出来。
图2.用Amplite 高斯荧光素酶报告基因检测试剂盒(蓝线)和市售的高斯荧光素酶检测试剂盒(红线)在带有NOVOstar酶标仪(BMG Labtech)的白色96孔板中检测了分泌的高斯荧光素酶。
Amplite 高斯荧光素酶报告基因检测试剂盒使用专有的发光配方来定量细胞培养基中的荧光素酶活性。当与高斯荧光素酶相互作用时,该发光产物会产生非常强的荧光光。该试剂盒提供了与HTS兼容的所有基本组件。它们具有很高的灵敏度,可以在96孔和384孔微量滴定板上进行实验。该测定法与标准细胞生长培养基兼容。
海肾萤光素酶
海肾萤光素酶是一种从Renilla reniformis分离的36 kDa蛋白。与萤火虫荧光素酶相比,海肾荧光素酶的底物和辅因子要求不同。海肾荧光素酶在氧气存在下使用腔肠素,产生480 nm的蓝光。与萤火虫萤光素酶类似,海肾萤光素酶因其底物要求和光输出的差异而可用于双重报告检测。
图3.用Amplite Renilla荧光素酶报告基因基因检测试剂盒在白色的96孔板中用NOVOstar酶标仪(BMG Labtech)检测了Renilla荧光素酶
Amplite 海肾萤光素酶报告基因检测试剂盒提供了一种快速,灵敏的方法,可以使用专有的发光配方在基于细胞的检测中检测海肾萤光素酶的活性。与海肾荧光素酶相互作用后,该试剂会产生具有强发光的产物。该测定法与标准细胞生长培养基兼容。该试剂盒可测量野生型和合成hRluc基因的原始表达或基因表达。可以在96孔和384孔微量滴定板形式进行实验。
表1.特定的萤光素酶的特异性、辅因子要求以及物理特性
生物名称 | 萤光素酶 | 大小(kDa) | 基质 | 需求 | 分泌 |
Photinus pyralis | 北美萤火虫荧光素酶 | 61 | D-萤光素 | 镁,ATP | 否 |
Luciola cruciata | 日本萤火虫(Genji-botaru)萤光素酶 | 64 | D-萤光素 | 镁,ATP | 否 |
Luciola italica | 意大利萤火虫萤光素酶 | 64 | D-萤光素 | 镁,ATP | 否 |
Luciola lateralis | 日本萤火虫(Heike)萤光素酶 | 64 | D-萤光素 | 镁,ATP | 否 |
Luciola mingrelica | 东欧萤火虫荧光素酶 | 64 | D-萤光素 | 镁,ATP | 否 |
Photuris pennsylvanica | 宾夕法尼亚萤火虫萤光素酶 | 64 | D-萤光素 | 镁,ATP | 否 |
Pyrophorus plagiophthalamus | 叩头虫萤光素酶 | 64 | D-萤光素 | 镁,ATP | 否 |
Phrixothrix hirtus | 铁虫荧光素酶 | 64 | D-萤光素 | 镁,ATP | 否 |
Renilla reniformis | 海肾荧光素酶 | 36 | 腔肠素 | 不适用 | 否 |
Rluc8(海肾荧光素酶的突变体) | 36 | 腔肠素 | 不适用 | 否 | |
绿色海肾荧光素酶 | 36 | 腔肠素 | 不适用 | 否 | |
Gaussia princeps | 高斯荧光素酶 | 20 | 腔肠素 | 不适用 | 是 |
高斯硬脑膜荧光素酶 | 20 | 腔肠素 | 不适用 | 是 | |
Cypridina noctiluca | 蓝藻荧光素酶 | 62 | 海萤荧光素 | 不适用 | 是 |
Cypridina hilgendorfii | Cypridina (Vargula) 荧光素酶 | 62 | 海萤荧光素 | 不适用 | 是 |
Metridia longa | Metridia荧光素酶 | 23.8 | 腔肠素 | 不适用 | 是 |
Oplophorus gracilorostris | OLuc | 19 | 腔肠素 | 不适用 | 是 |
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