Calcein AM，中文名钙黄绿素乙酰氧基甲酯，是一种可渗透进入细胞、常用于测定真核细胞活力或线粒体通透性转换孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore, MPTP)的绿色荧光探针。Calcein AM近年来被广泛应用到细胞活性分析实验中。

荧光显微镜

Ex:               TRITC 滤波片组

Em：              TRITC 滤波片组

推荐孔板:         黑色透明底板

荧光酶标仪

Ex:              540 nm

Em：             590 nm

Cutoff：        570 nm

推荐孔板:       黑色透明底板

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实验方案：

操作步骤

1.准备HHBS缓冲液，10％Pluronic®F-127溶液和25 mM Probenecid溶液。
2.在高质量无水DMSO中制备2 mM至5 mM Calcein Red AM原液。
2.1使用Calcein Red AM的量：1毫克
2.2所需浓度：2 mM
2.3在合适的容器中，将1mg Calcein Red TM AM与492.23μL无水DMSO混合。
 

3.使用10μMCalceinRed AM 4在HHBS中制备2X工作溶液，0.08％Pluronic®F-127和2 mM丙磺舒。
3.1终孔内浓度的Calcein Red AM：5μM
3.2Pluronic®F-127的终井内浓度：0.04％
3.3终孔内浓度的丙磺舒：1mM
3.4在合适的容器中，混合16μL的Calcein Red AM，25.6μL的10％Pluronic F-127和256μL的25mM丙磺舒。然后，添加HHBS或您选择的缓冲液，直到体积为3.2 mL。
注意：对于大多数细胞系，我们建议Calcein Red AM的终浓度为4至5μM。
注意：推荐的Pluronic F-127孔浓度终为0.02％至0.04％。
注意：推荐的终浓度为1至2.5 mM的Probenecid。
 

4.将100μL染料工作溶液加入已经含有100μL培养基的所需孔中。
4.1该步骤将染料工作溶液从2X稀释至1X，并将每种组分的终浓度调节至以下：5μM的Calcein Red AM，0.04％Pluronic F-127,1mM丙磺舒。
 

5.孵育染料
5.1将染料加载板在细胞培养箱中孵育20-60分钟。
5.2将染料加载板在室温下孵育30分钟。
 

6.用1.0 mM Probenecid准备HHBS缓冲液（或您选择的缓冲液）。
6.1在合适的容器中加入160μL的25mM丙磺舒。然后，添加HHBS或您选择的缓冲液，直到体积为4 mL。

7.用HHBS缓冲液或您选择的缓冲液替换染料工作溶液，使用1.0 mM Probenecid。
7.1首先，从所需孔中除去200μL染料工作溶液和培养基。
7.2在相同的孔中加入200μL含有1.0mM丙磺舒的HHBS（或您选择的缓冲液）。
 

8.运行实验
8.1为您的样品添加所需的处理。
8.2以Ex / Em = 560/574 nm运行实验

图1所示。海拉细胞生活的照片沾钙黄绿素红TM, (Cat.21900)。细胞核染色了赫斯特33342年(蓝色, 17535)。

图2。海拉细胞彩色图像用钙黄绿素红?。左:活海拉细胞;右:固定的海拉细胞。