线粒体膜电位荧光探针的流式细胞术检测是通过特异性荧光探针标记线粒体膜电位变化，再利用流式细胞仪定量分析细胞群体中线粒体膜电位状态的技术，其核心步骤和原理如下：

一、检测原理

线粒体膜电位（ΔΨm）是线粒体功能的重要指标，正常细胞的线粒体因质子泵作用维持较高的膜电位，而凋亡或受损细胞的膜电位会下降或丧失。线粒体膜电位荧光探针可依据膜电位差异选择性富集于线粒体：

阳离子型探针（如 JC-1、TMRM、TMRE 等）因线粒体的负电荷内环境，会主动聚集于正常线粒体中，发出强荧光；当膜电位下降时，探针外排，荧光强度减弱。

如线粒体膜电位荧光探针JC-1在高膜电位下聚合为红色荧光的J-聚集体，低膜电位下解聚为绿色荧光的单体，通过红绿荧光比值可更精准反映膜电位变化，减少细胞数量、探针浓度等因素的干扰。

二、实验步骤

细胞准备与处理

收集对数生长期的细胞（如贴壁细胞经胰酶消化，悬浮细胞直接离心），用PBS洗涤2-3次，调整细胞浓度至 1×10?-5×10?个/mL，避免细胞过度密集影响染色效果。

若需检测药物、应激等处理对膜电位的影响，需设置对照组（未处理细胞）和实验组，按处理条件孵育相应时间后进行后续操作。

荧光探针染色

根据探针类型选择合适的染色方案：

JC-1染色：将细胞悬液与JC-1工作液（终浓度通常为1-10μM，具体浓度需预实验优化）混合，37℃、5% CO?培养箱中避光孵育15-30分钟，期间探针通过细胞膜进入细胞，在正常线粒体中形成红色荧光聚集体，在膜电位下降的线粒体中以绿色荧光单体存在。

TMRM/TMRE 染色：此类探针为单价阳离子，染色浓度通常为50-200nM，避光孵育20-30分钟，其荧光强度与膜电位正相关，无需洗涤即可检测（或用预热的PBS短暂洗涤去除胞外游离探针，减少背景荧光）。

染色结束后，用预热的PBS或染色缓冲液洗涤细胞2次，去除未进入细胞的游离探针，避免背景干扰。

流式细胞仪检测参数设置

激发与发射波长选择：JC-1的绿色单体激发波长约488nm，发射波长525nm（FITC通道）；红色聚集体激发波长 488nm，发射波长585nm（PE通道）。TMRM/TMRE 的激发波长488nm，发射波长575nm左右（PE或Texas Red通道）。

仪器校准：使用荧光微球校准流式细胞仪的光电倍增管（PMT）电压，确保不同实验间的检测一致性；设置阴性对照（未染色细胞）确定自发荧光本底，设置单染对照调整荧光补偿，避免通道间的荧光串扰。

数据采集与分析

上机检测时，每个样本收集10,000-20,000个细胞，记录荧光强度数据。

数据分析中，通过流式软件（如FlowJo）圈定目标细胞群体（排除碎片和死细胞，可结合PI或DAPI染色区分死细胞），计算：

JC-1：红色荧光（PE通道）与绿色荧光（FITC通道）的比值，比值下降表明膜电位降低；

TMRM/TMRE：直接分析阳性细胞的平均荧光强度（MFI），MFI降低提示膜电位下降。

结果需结合对照组，统计实验组膜电位异常细胞的比例及荧光强度变化，以量化膜电位的改变程度。

三、关键注意事项

探针浓度与孵育时间：过高浓度可能导致非特异性染色，过低则信号弱，需通过预实验确定适宜条件；孵育需避光，避免探针光漂白。

温度控制：染色过程需维持37℃，确保细胞活性和线粒体功能稳定，低温可能影响探针摄取。

阴性与阳性对照：阴性对照（未染色细胞）用于设定荧光阈值，阳性对照（如用CCCP处理的细胞，CCCP为解偶联剂，可显著降低膜电位）用于验证实验体系的有效性。

通过上述方法，流式细胞术可快速、定量地检测细胞群体中线粒体膜电位的变化，广泛应用于细胞凋亡、线粒体功能损伤等研究领域。

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