细胞活性检测是材料生物相容性评价的核心环节，通过细胞活性检测试剂盒（如CCK-8、MTT、MTS、WST-1等）可量化材料对细胞增殖、存活及代谢活性的影响，为材料生物安全性与适用性提供关键数据。其标准化流程需严格遵循“样品制备-细胞接种-材料暴露-检测实施-数据处理-结果判定”的闭环逻辑，兼顾实验重复性、准确性与可比性，具体如下：

一、前期准备：试剂、材料与细胞体系的标准化

1. 核心试剂与耗材选型

细胞活性检测试剂盒选择：优先选用灵敏度高、稳定性好、操作简便的试剂盒，主流类型及适配场景为：CCK-8（水溶性、无细胞毒性、检测快速，适用于高通量筛选）、MTT（经典方法、成本较低，需有机溶剂溶解甲臜，适用于常规检测）、WST-1（比 MTT 灵敏度高、反应速度快，适合短时间暴露实验）；需确保试剂盒在有效期内，按说明书要求储存（通常2~8℃避光保存）。

细胞株选择：根据材料应用场景选取代表性细胞株，如医用材料（皮肤、黏膜接触）优先选用 L929小鼠成纤维细胞、HaCaT人角质形成细胞；骨科材料选用MC3T3-E1成骨细胞、RAW264.7破骨细胞；心血管材料选用HUVEC人脐静脉内皮细胞；细胞需处于对数生长期（汇合度70%~80%），活性≥95%，无支原体污染。

耗材与培养基：采用无菌一次性培养板（96孔板为首选，适配试剂盒检测体积）、移液枪头、离心管等；培养基需与细胞株匹配（如DMEM、RPMI-1640），添加10%胎牛血清（FBS）、1%双抗（青霉素/链霉素），确保培养基无浑浊、无污染，pH值稳定在7.2~7.4。

2. 材料样品的标准化制备

样品处理：根据材料形态（固体、液体、粉末）进行适配处理：

固体材料：切割为与培养孔适配的尺寸（如 96 孔板中直径 6~8mm 的圆片），确保表面平整、无毛刺，经无菌处理（如高压蒸汽灭菌、环氧乙烷灭菌）后，用 PBS 冲洗 3 次去除灭菌残留；若材料为多孔结构，需提前浸泡在培养基中平衡24h，避免孔内空气影响细胞附着。

液体材料（如涂层液、提取物）：用培养基稀释为系列浓度（如10%、20%、50%、100% 体积分数），通过0.22μm滤膜过滤除菌，避免直接添加导致细胞污染。

粉末材料：用培养基分散制备成悬浮液，超声处理10~15min确保均匀分散，避免颗粒团聚影响细胞接触。

材料提取物制备（若适用）：按ISO 10993-12标准，以材料质量/提取介质体积比（如1g/10mL），在37℃、5% CO?条件下提取24~72h，提取液经离心（10000r/min，10min）、过滤除菌后备用，模拟材料在体内的溶出行为。

二、实验操作：从细胞接种到检测的标准化步骤

1. 细胞接种与培养

细胞制备：将对数生长期的细胞用胰酶消化后，加入培养基终止消化，离心（1000r/min，5min）收集细胞，重悬并计数，调整细胞浓度至 1×10?~5×10? cells/mL（根据细胞大小与生长速率调整，确保实验结束时细胞汇合度不超过80%）。

接种与预培养：向96孔培养板中每孔加入100μL细胞悬液，边缘孔用无菌PBS填充（避免蒸发导致边缘效应）；将培养板置于37℃、5% CO?培养箱中预培养24h，使细胞贴壁生长，形成均匀的细胞单层。

2. 材料暴露与孵育

对照组设置：必须包含3类对照，确保结果有效性：

空白对照组：仅加培养基，无细胞与材料，用于扣除背景吸光度；

阴性对照组：加细胞与培养基，无材料（或添加无菌惰性材料如高纯度钛片），作为细胞正常生长的参照；

阳性对照组：加细胞、培养基与已知细胞毒性物质（如0.1% Triton X-100、50μmol/L H?O?），用于验证实验体系的敏感性。

材料处理：吸弃预培养后的培养基，向实验组孔中加入含材料（或材料提取物）的新鲜培养基100μL，确保材料与细胞充分接触（固体材料需完全覆盖细胞单层，液体/粉末材料均匀分散）；每组设置3~6个复孔，减少实验误差。

孵育条件：将培养板放回培养箱，根据实验目的设置孵育时间，常规为24h、48h、72h（短期评价），长期评价可延长至7~14天；孵育期间避免频繁开关培养箱，维持温度、湿度与CO?浓度稳定。

3. 试剂盒检测操作

试剂添加：按试剂盒说明书要求，向每孔加入相应体积的检测试剂（如CCK-8试剂10μL/100μL 培养基、MTT试剂20μL/100μL培养基），轻轻摇晃培养板使试剂均匀混合。

孵育反应：CCK-8、WST-1需在37℃孵育1~4h（根据细胞活性调整，确保吸光度在仪器检测线性范围内）；MTT 需孵育4h后，吸弃上清液，每孔加入150μL DMSO溶解甲臜结晶，振荡 10min 确保完全溶解。

吸光度测定：使用酶标仪在试剂盒指定波长下测定吸光度（如CCK-8检测波长450nm，参考波长630nm；MTT检测波长570nm，参考波长630nm）；测定前需将培养板在室温下平衡10min，避免温度差异影响检测结果。

三、数据处理与结果判定：标准化分析方法

1. 数据预处理

背景扣除：将实验组与对照组的吸光度值减去空白对照组的吸光度值，消除培养基与检测试剂的背景干扰。

异常值剔除：采用Grubbs法剔除复孔中的异常值（通常 P＜0.05），确保数据可靠性；若某组复孔的相对标准偏差（RSD）＞15%，需重新实验。

2. 关键指标计算

细胞相对活性（RGR）：RGR（%）=（实验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值）×100%，反映材料对细胞活性的影响（RGR 越高，细胞活性越好，材料生物相容性越优）。

半数抑制浓度（IC??）：通过绘制 RGR 与材料浓度（或提取物浓度）的剂量-效应曲线，采用非线性回归拟合得到 IC??值，用于量化材料的毒性强度（IC??值越大，材料毒性越低）。

3. 生物相容性等级判定（参考ISO 10993-5标准）

根据细胞相对活性（RGR）划分材料生物相容性等级：

0 级（无细胞毒性）：RGR≥100%；

1 级（轻微细胞毒性）：75%≤RGR＜100%；

2 级（中度细胞毒性）：50%≤RGR＜75%；

3 级（重度细胞毒性）：25%≤RGR＜50%；

4 级（严重细胞毒性）：RGR＜25%；

判定标准：医用材料需达到0~1级方可认为具有良好生物相容性；若用于体内植入材料，RGR需≥80%，且无明显剂量依赖性毒性。

四、质量控制与注意事项

1. 实验过程质量控制

无菌操作：全程严格遵循无菌技术，避免细菌、真菌污染导致实验失败；所有接触细胞的试剂、耗材需提前灭菌或除菌处理。

边缘效应控制：96孔板边缘孔易因蒸发导致培养基浓度变化，需用PBS填充，或仅使用中间60孔进行实验。

试剂反应控制：检测试剂需现配现用（如MTT试剂），避免反复冻融；孵育时间需严格控制，过长或过短均会导致吸光度偏离真实值。

2. 常见问题与解决方案

细胞活性偏低（阴性对照组RGR＜80%）：可能是细胞状态不佳、培养基污染或孵育条件异常，需更换对数生长期细胞、新鲜培养基，检查培养箱参数。

实验组吸光度波动大：可能是材料分散不均（粉末/液体材料）或固体材料与细胞接触不充分，需优化材料处理方法（如延长超声时间、调整材料尺寸）。

背景吸光度过高：可能是检测试剂变质或培养基成分干扰，需更换试剂盒，或选用无酚红培养基减少干扰。

3. 结果的局限性与补充验证

局限性：细胞活性检测仅反映材料对细胞代谢或增殖的影响，无法完全替代体内生物相容性评价（如炎症反应、组织整合性）；不同细胞株对材料的敏感性存在差异，单一细胞株结果需结合多种细胞验证。

补充验证：若需更全面评价，可结合细胞形态观察（倒置显微镜观察细胞贴壁、伸展状态）、凋亡检测（Annexin V/PI 染色）、炎症因子分泌检测（ELISA法）等技术，形成多维度评价体系。

细胞活性检测试剂盒在材料生物相容性评价中的标准化流程，核心是通过“样品制备标准化、实验操作规范化、数据处理系统化”确保结果的可靠性与可比性。关键要点包括：选择适配的试剂盒与细胞株、严格设置对照体系、控制材料与细胞的接触条件、精准执行检测步骤，以及按ISO 10993标准进行结果判定。该流程适用于医用材料、食品接触材料、环境功能材料等各类材料的初步生物相容性筛查，为材料的研发、优化与产业化提供重要的安全依据。实际应用中，需根据材料特性与应用场景灵活调整实验参数，必要时结合体内实验与长期毒性评价，全面保障材料的生物安全性。

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