一.百萤 ATTO 647N 马来酰亚胺工作原理

基于罗丹明的 ATTO 647N 是一种红色荧光标记，具有与 Cy5 相似的光谱特性。它具有强吸收、高荧光量子产率以及出色的热稳定性和光稳定性。值得注意的是，其吸收和荧光不受 2 至 11 的 pH 值变化的影响。与花青染料不同，ATTO 647N 在大气臭氧存在下表现出出色的稳定性，这使其对于微阵列应用特别有价值。 ATTO 647N 适合一系列科学应用，包括单分子检测、SIM 和 STED 等高分辨率显微镜技术，以及流式细胞术 (FACS) 和荧光原位杂交 (FISH)。 ATTO 647N 马来酰亚胺用于标记含硫醇的分子，例如蛋白质、抗体、配体和寡核苷酸硫代磷酸盐。

图1.荧光染料马来酰亚胺是通过 SH 基团将染料与肽、蛋白质、抗体、硫醇修饰的寡核苷酸或核酸结合的常用工具。马来酰亚胺在中性条件下很容易与蛋白质的硫醇基团、硫醇修饰的寡核苷酸和其他含硫醇的分子发生反应。所得的染料缀合物相当稳定。

二.百萤 ATTO 647N 马来酰亚胺参数

Ex(nm)    318

Em(nm)    663

分子量    N/A

溶剂      DMSO

存储条件    在-15℃以下保存，避光防潮

三.百萤 ATTO 647N 马来酰亚胺实验方案

溶液配制方案

除非另有说明，所有未使用的储备溶液应分成一次性等份，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。

1.ATTO 647N 马来酰亚胺储备溶液（溶液 B） ：

将无水 DMSO 添加到 ATTO 647N 马来酰亚胺小瓶中，制成 10 mM 储备溶液。通过移液或涡旋充分混合。

注意：

开始缀合前准备染料储备溶液（溶液 B）。及时使用。延长储存染料原液可能会降低染料活性。避光防潮时，溶液 B 可在冰箱中保存长达 4 周。避免冻融循环。

2. 蛋白原液（A液）

将 100 μL 反应缓冲液（例如，pH ~6.0 的 100 mM MES 缓冲液）与 900 μL 目标蛋白溶液（例如抗体，蛋白浓度 > 2 mg/mL 如果可能）混合，得到 1 mL 蛋白标记库存溶液。

注1：蛋白质溶液（溶液 A）的 pH 应为 6.5 ± 0.5。

注2：不纯的抗体、稳定的牛血清蛋白（BSA）抗体或明胶不会被很好的标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞，以获得标记结果。

注3：如果蛋白质浓度低于 2 mg/mL，结合效率会显着降低。为了获得标记效率，建议蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。

可选：如果您的蛋白质不含游离半胱氨酸，则必须用 DTT 或 TCEP 处理蛋白质以生成硫醇基团。 DTT 或 TCEP 用于将二硫键转化为两个游离硫醇基团。如果使用 DTT，则必须在将马来酰亚胺染料与蛋白质结合之前通过透析或凝胶过滤除去游离 DTT。以下是生成游离硫醇基团的示例方案：

1.在蒸馏水中制备 1 M DTT (15.4 mg/100 μL) 的新鲜溶液。

2.在 20 mM DTT 中制备 IgG 溶液：混合时每 ml IgG 溶液添加 20 μL DTT 库存。在室温下静置 30 分钟，无需额外混合（以尽量减少半胱氨酸再氧化为胱氨酸）。

3.将还原的 IgG 通过用“交换缓冲液”预平衡的过滤柱。从柱中收集 0.25 mL 馏分。

4.确定蛋白质浓度并将大部分 IgG 的级分合并。这可以通过分光光度法或比色法来完成。

5.此步骤后尽快进行缀合（请参阅示例实验方案）。

注意：为了获得结果，IgG 溶液应 >4 mg/mL。如果抗体低于 2 mg/mL，则应浓缩。额外包括 10% 的缓冲液交换柱损失。

注意：几乎可以在 pH 7-7.5 的任何缓冲液中进行还原，例如 MES、磷酸盐或 TRIS 缓冲液。

注意：步骤 3 和 4 可以用透析代替。

样品实验方案：

该标记方案是针对山羊抗小鼠 IgG 与 ATTO 647N 马来酰亚胺的缀合物而开发的。请您根据您的实际情况，进行操作。

注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的特性。蛋白质的过度标记可能会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。

运行缀合反应：

1.使用 10:1 摩尔比的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）作为起点：将 5 μL 染料储备溶液（溶液 B，假设染料储备溶液为 10 mM）添加到蛋白质小瓶中溶液（95 μL 溶液 A）并有效摇动。假设蛋白质浓度为 10 mg/mL，蛋白质的分子量为 ~200KD，则蛋白质浓度为 ~0.05 mM。

注意：我们建议使用溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）摩尔比为 10:1 的溶液。如果太少或太高，则分别确定染料/蛋白质比例为 5:1、15:1 和 20:1。

2.继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

纯化缀合：

以下方案是使用 Sephadex G-25 柱纯化染料-蛋白质缀合物的示例。

1.根据制造说明准备 Sephadex G-25 柱。

2.将反应混合物（来自“运行缀合反应”）加载到 Sephadex G-25 柱的顶部。

3.当样品刚好流到顶部树脂表面下方时，立即添加 PBS（pH 7.2-7.4）。

4.向所需样品中添加更多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成柱纯化。合并含有所需染料-蛋白质缀合物的级分。

注意：如需立即使用，染料-蛋白质缀合物需要用染色缓冲液稀释，并等分多次使用。

注意：为了长期储存，染料-蛋白质缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。