线粒体膜电位（MMP）荧光探针的检测流程需结合细胞特性与探针原理进行操作，以下为通用检测流程及关键要点：

一、实验前准备与探针选择

探针类型：常用线粒体膜电位荧光探针如 JC-1（单体呈绿色荧光，聚集态呈红色荧光，适用于流式细胞术或荧光显微镜）、TMRE/TMRM（阳离子红色荧光探针，适用于定量检测），根据实验目的（定性观察/定量分析）选择探针并按说明书配制工作液（通常用无血清培养基或缓冲液稀释，避免血清蛋白干扰探针结合）。

细胞准备：培养目标细胞（如干细胞）至对数生长期，用胰酶消化或吹打制成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至1×10?-1×10?cells/mL。

二、探针负载与孵育

负载条件：取适量细胞悬液加入离心管，1000 rpm 离心5分钟，弃上清后用预热的无血清培养基重悬；按比例加入线粒体膜电位荧光探针工作液（如JC-1终浓度5-10μg/mL，TMRE 终浓度 10-20 nM），轻轻混匀后于37℃、5% CO?培养箱中避光孵育15-30分钟（时间过长可能导致探针聚集非特异性增强，过短则负载不足）。

清洗步骤：孵育结束后，1000 rpm 离心 5 分钟，弃染液，用预热的 PBS 或无血清培养基洗涤 2-3 次，去除未结合的线粒体膜电位荧光探针，避免背景荧光干扰。

三、检测与信号采集

1. 荧光显微镜观察（定性分析）

将清洗后的细胞重悬于适量培养基，滴加至载玻片或培养皿中，置于荧光显微镜下；使用对应滤光片（如 JC-1 的绿色通道 Ex/Em=488/525 nm，红色通道 Ex/Em=560/590 nm）观察，正常细胞因高膜电位呈现红色荧光（JC-1 聚集态），凋亡或受损细胞因膜电位降低呈现绿色荧光（JC-1 单体），拍照记录并对比各组细胞荧光分布。

2. 流式细胞术（定量分析）

清洗后的细胞用 PBS 重悬，调整浓度至 1×10? cells/mL，立即上流式细胞仪检测；设定激发光与发射光参数（如 TMRE 用 488 nm 激发，630 nm 发射），通过流式软件分析荧光强度，膜电位越高，线粒体膜电位荧光探针聚集越多，荧光强度越强，可通过平均荧光强度（MFI）量化不同处理组的膜电位差异。

3. 荧光酶标仪（高通量定量）

若使用 96 孔板培养细胞，可直接在孵育清洗后，用酶标仪读取荧光值（如 JC-1 的红绿荧光比值，或 TMRE 的单一通道荧光），需注意每孔细胞数量一致，避免细胞密度差异影响结果，适用于药物筛选等高通量实验。

四、对照设置与数据处理

阳性对照：使用膜电位破坏剂（如 CCCP，羰基氰化物 3 - 氯苯腙）处理细胞，诱导膜电位崩解，作为低膜电位参照；阴性对照为未处理正常细胞，用于校准荧光背景。

数据处理：流式或酶标仪数据需用统计学方法（如 ANOVA、t 检验）分析组间差异，荧光显微镜图像可通过 ImageJ 等软件定量分析红绿荧光比值或平均强度，结合实验重复次数（建议 n≥3）确保结果可靠性。

五、注意事项

探针毒性：部分探针（如高浓度 JC-1）长时间孵育可能影响细胞活性，需优化负载浓度与时间；

温度与避光：操作过程保持 37℃预热试剂，避免低温影响线粒体功能，探针需全程避光以防光漂白；

细胞状态：确保细胞无凋亡或坏死（可通过台盼蓝染色预处理筛选活细胞），避免非特异性膜电位变化干扰结果。

通过上述流程，可高效检测线粒体膜电位变化，为细胞功能评估（如干细胞质量、细胞凋亡研究）提供量化依据。

本文来源于西安百萤生物科技有限公司官网 http://www.bybiolite.com/