该模板DNA带有大量dATP，dGTP，dCTP和dTTP的混合物。加入四种双脱氧核苷酸（ddATP，ddGTP，ddCTP和ddTTP）的混合物，每种混合物均以限量存在，并分别用发不同颜色的荧光的“标签”标记。因为所有四个正常核苷酸都存在，所以链延伸正常进行，直到偶然地DNA聚合酶插入ddNTP（而不是正常dNTP）。