该模板DNA带有大量dATP，dGTP，dCTP和dTTP的混合物。加入四种双脱氧核苷酸（ddATP，ddGTP，ddCTP和ddTTP）的混合物，每种混合物均以限量存在，并分别用发不同颜色的荧光的“标签”标记。因为所有四个正常核苷酸都存在，所以链延伸正常进行，直到偶然地DNA聚合酶插入ddNTP（而不是正常dNTP）。如果正常核苷酸与双脱氧形式的比率足够高，则在插入ddNTP之前，某些DNA链将成功添加数百个核苷酸，从而终止该过程。在孵育期结束时，片段的长度从长到短分离，一个核苷酸之间的差异足以使该链与下一较短和下一较长链分开。当被激光束照射时，四个DDNTP中的每一个都会发出不同的荧光，可以通过自动扫描仪打印输出序列。这些ddATP，ddGTP，ddCTP和ddTTP胺衍生物是开发Sanger测序试剂的重要组成部分。