小伙伴们，是不是在使用Fluo-4AM的操作过程中，常出现一些问题，导致实验数据不理想？小萤总结了四大典型问题及其解决方案，助您扫清障碍，获得可靠数据。

一、染料泄漏：为何信号总是“不告而别”？

当您发现荧光信号在衰减，首先要考虑的是染料是否从细胞中泄漏。

核心原因：不同细胞类型的染料滞留能力不同，通用方案可能不适用于您的特定细胞。

解决方案：

方案优化：首先确认您的实验方案已针对所用细胞系进行过优化，包括孵育时间、温度及浓度。

物理化学抑漏：可尝试降低环境温度或向培养基中添加丙磺舒，以抑制染料外排。但需注意，这些方法可能带来副作用，需预实验验证。

终极方案——探针升级：若实验对稳定性要求极高，推荐您使用 Fluo-8® AM。作为Fluo-4的升级版，它具有卓越的细胞滞留能力，能从根本上减少泄漏，确保长时间成像的信号稳定。

二、加载不一致：为何结果总是“时好时坏”？

加载效率不稳定会直接导致实验重复性差，其根源通常在于细胞本身与培养环境。

核心原因：

细胞状态不佳：制备不当或传代过度的细胞，其负载能力会显著下降。

培养基干扰：血清中的酯酶会提前水解AM酯，导致染料在胞外激活，加载失败。

解决方案：

确保细胞健康：使用状态良好、传代稳定的细胞进行实验。

使用无血清培养基加载：这是必须遵守的关键步骤，可有效避免非特异性水解。

采用标准化试剂盒：使用配套的钙检测试剂盒，能通过优化好的标准化流程，提升实验的重复性与成功率。

面对Fluo-4 AM的挑战，一个系统化的解决方案至关重要。从优化基础方案，到在关键节点升级探针（Fluo-8® AM、Mag-Fluo-4 AM），再到针对特定浓度范围选择高匹配度工具（如Calbryte? 520 AM、Fluo-8FF? AM），百萤生物为您提供全方位支持。

采用 Calbryte? 520 AM（货号 20653）和 Fluo-4 AM（货号 20550）检测 CHO-K1 细胞的 ATP 反应。实验方法如下：

将 CHO-K1 细胞以每孔 50,000 个细胞 / 100 μL 的密度接种到 96 孔板 或透明底 Costar 培养板中，过夜培养。向各孔中加入 100 μL 染料加载液（含 10 μg/mL Calbryte? 520 AM 的 HH 缓冲液，或含 10 μg/mL Fluo-4 AM 的 HH 缓冲液，两种缓冲液均添加丙磺舒），在 37°C 条件下孵育 45 分钟。移除两种染料加载液后，每孔加入 200 μL HH 缓冲液。随后加入 50 μL 每孔的 ATP，使终浓度达到所示的 10 μM。使用 显微镜在 FITC 通道采集图像。